Kultur Jaringan

I.PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Penyerbukan dan pembuahan dapat berhasil namun setelah persilangan buatan seringkali dijumpai permasalahan antara lain buah yang terbentuk gugur saat embrio belum matang, terbentuk buah dengan endosperm yang kecil atau terbentuk buah dengan embrio yang kecil dan lemah. Kondisi tersebut dapat menghambat program pemuliaan tanaman karena embrio muda, embrio dengan endosperm kecil atau embrio kecil dan lemah seringkali tidak dapat berkecambah secara normal dalam kondisi biasa.

Untuk mengatasi hal tersebut di atas maka embrio tersebut dapat diselamatkan dan ditanam secara aseptis dalam media buatan sehingga dapat berkecambah dan menghasilkan tanaman utuh. Teknik untuk menanam embrio muda ini dikenal dengan sebutan penyelamatan embrio (embryo rescue).

Selain teknik penyelamatan embrio ini dikenal juga teknik kultur embrio (embryo culture), yaitu penanaman embrio dewasa pada media buatan secara aseptis. Embrio culture adalah salah satu teknik kultur jaringan yang pertama kali berhasil. Aplikasi kultur embrio ini antara lain perbanyakan tanaman, pematahan dormansi untuk mempercepat program pemuliaan serta perbanyakan tanaman yang sulit berkecambah secara alami.

Kultur embrio adalah isolasi secara steril embrio matang ataupun belum matang dengan tujuan memperoleh tanaman yang viabel. Ada 2 macam didalam kultur embrio yaitu kultur embrio yang belum matang untuk mencegak keguguran (embrio rescue) dan kultur embrio matang untuk merangsang perkecambahan (embrio culture). Aplikasi kultur embrio akan bertujuan untuk memecahkan dormansi, perkecambahn parasit obligat, memerpendek siklus pemuliaan tanaman, menghasilkan tanaman haploid, mencegah aborsi pada buah, mencegah aborsi pada persilangan interspesifik dan pembiakan vegetatif (htttp://www.wikipedia.com.Pengertian Kultur Embrio, 2009).

Faktor – faktor yang mempengaruhi kesuksesan didalam kultur embrio adalah : Genotipe (contohnya pada suatu species embrio mudah diisolasi dan tumbuh sementara tanaman lain susah), tahap embrio diisolasi, tergantung tumbuh tanaman inang (sebaiknya ditumbuhkan dirumah kaca atau kondisi terkontrol, embrio harus cukup besar dan berkualitas tinggi), kondisi media (hara makro dan mikro, ph 5 – 6), sukrosa sebagai sumber energi, zat pengatur tumbuh yang digunakan GA (Giberelin) untuk memecahkan dormansi, vitamin dan senyawa organik dan lingkungan (cahaya, oksigen, suhu kadang untuk perlakuan dingin atau vernilisasi) untuk memecahkan dormansi (Nigel and Fowler, 2007).

Kultur anther menjadi salah satu teknik kultur jaringan yang sangat menjanjikan untuk pemuliaan tanaman dan telah diaplikasikan secara meluas pada tanaman serealia dan beberapa tanaman lain (Dunwell, 1996; Sopory dan Munshi, 1996). Untuk pemuliaan anthurium sendiri, baik kultur anther maupun mikrospora belum pernah dikembangkan, sehingga penelitian ini memiliki arti penting di masa datang untuk pengembangan tanaman anthurium. Hasil pengembangan anthurium ini nantinya dapat meningkatkan keberhasilan pemuliaan tanaman maupun perbenihannya.

Tanaman haploid dapat dikembangkan dengan menggunakan teknik kultur in vitro anther dan pollen. Anther diperoleh dari tunas bunga dan dapat dikulturkan pada medium padat atau cair sehingga terjadi embriogenesis. Selain itu pollen juga dapat diambil secara aseptik dan dikulturkan pada medium cair. Proses perbanyakan tanaman haploid dengan menggunakan gametofit jantan semacam ini disebut sebagai androgenesis. Ada dua macam androgenesis yaitu androgenesis langsung dan tidak langsung. Androgenesis langsung adalah proses pembentukan plantlet haploid dengan menggunakan kultur anther, sedangkan pada androgenesis tidak langsung adalah plantlet terbentuk melalui pembentukan kalus yang kemudian mengalami regenerasi menjadi plantlet (Yuwono, 2008).

Kultur adalah inisiasi umum dari tumbuh-tumbuhan yang memiliki bagian-bagian yang dapat ditumbuhkan pada media kultur dan dapat disterilkan, sementara eksplan adalah ketika dikulturkan pada medium yang sesuai, biasanya media terdiri dari bahan-bahan auxin dan sitokinin, yang dapat memberikan suatu nutrisi bagi tanaman agar dapat tumbuh dan berkembang menjadi suatu individu baru (Bennet dan O’Neill, 1989).

Biotekologi tanaman membuat suatu program yang dapat menghebohkan publik. Dalam beberapa tahun terkahir bioteknologi tanaman berkembang pesat sehingga mampu meningkatkan hasil-hasil produksi baik tanaman pangan maupun tanaman perkebunan (Slater at al, 2003).

1.2.Tujuan

Adapun tujuan dilakukannya praktikum kultur embrio ini adalah untuk menyelamatkan embrio dari ketidak cocokan dengan endosperm apabila endosperm tidak terbentuk. Serta tujuan dilakukannya praktikum kultur anther adalah untuk menghasilkan tanamn monohaploid yang dapat digunakan untuk pemuliaan tanaman selanjutnya.

 II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kultur Embrio

Pada program pemuliaan tanaman, biasanya dilakukan persilangan buatan antara tanaman induk (P) untuk menghasilkan hibrid baru. Persilangan buatan lebih mudah berhasil bila dilakukan antar tanaman dengan hubungan kekerabatan yang dekat. Untuk memperoleh sifat-sifat yang diinginkan, seringkali penyilangan dilakukan dengan tanaman liar atau bahkan persilangan dengan varietas yang berbeda bila sifat-sifat tersebut tidak terdapat pada kerabat dekatnya.

Penyerbukan dan pembuahan dapat berhasil namun setelah persilangan buatan seringkali dijumpai permasalahan antara lain buah yang terbentuk gugur saat embrio belum matang, terbentuk buah dengan endosperm yang kecil atau terbentuk buah dengan embrio yang kecil dan lemah. Kondisi tersebut dapat menghambat program pemuliaan tanaman karena embrio muda, embrio dengan endosperm kecil atau embrio kecil dan lemah seringkali tidak dapat berkecambah secara normal dalam kondisi biasa.

Untuk mengatasi hal tersebut di atas maka embrio tersebut dapat diselamatkan dan ditanam secara aseptis dalam media buatan sehingga dapat berkecambah dan menghasilkan tanaman utuh. Teknik untuk menanam embrio muda ini dikenal dengan sebutan penyelamatan embrio (embryo rescue).

Selain teknik penyelamatan embrio ini dikenal juga teknik kultur embrio (embryo culture), yaitu penanaman embrio dewasa pada media buatan secara aseptis. Aplikasi kultur embrio ini antara lain perbanyakan tanaman, pematahan dormansi untuk mempercepat program pemuliaan serta perbanyakan tanaman yang sulit berkecambah secara alami, misalnya anggrek.

Embryo Culture atau kultur embrio adalah isolasi steril dari embrio muda (immature embryo) atau embrio dewasa/tua (mature embryo) secara invitro dengan tujuan untuk memperoleh tanaman yang lengkap. Embrio culture adalah salah satu teknik kultur jaringan yang pertama kali berhasil, sejarahnya:

1. Tahun 1904, seorang ilmuwan bernama Hanning berhasil memperoleh tanaman sempurna dari embryo Cruciferae yang diisolasi secara invitro

2. Tahun 1924 adalah saat pertama kali dilakukan penelitian untuk memecahkan masalah dormansi biji secara invitro pada embrio Linum

3. Tahun 1933 Tuckey berhasil memperoleh tanaman dari immature embryo buah batu.

Kultur embrio berguna dalam menolong embrio hasil persilangan seksual antara spesies atau genera yang berkerabat jauh yang sering kali gagal karena embrio hibridanya mengalami keguguran. Kultur embrio telah digunakan untuk menghasilkan hibrida untuk beberapa spesies tanaman. Media kultur embrio mencakup garam-garam anorganik, sukrosa, vitamin, asam amino, hormon, dan substansi yang secara nutrisi tidak terjelaskan seperti santan kelapa. Embrio yang lebih muda membutuhkan media yang lebih kompleks dibandingkan dengan embrio yang lebih tua. Perpindahan embrio dari lingkungan normal dalam biji akan mengatasi hambatan yang ditimbulkan oleh kulit biji yang sulit ditembus (Nasir, 2002).

Kultur embrio belum matang yang diambil dari biji memiliki 2 macam aplikasi. Dalam beberapa hal, incompatibilitas antar spesies atau kultivar yang timbul setelah pembentukan embrio akan menyebabkan aborsi embrio. Embryo seperti ini dapat diselamatkan dengan cara mengkulturkan embrio yang belum matang dan menumbuhkannya pada media kultur yang sesuai. Aplikasi lain kultur embrio adalah untuk menyelamatkan embrio yang sudah matang agar tidak mati akibat serangan hama dan penyakit (http://www.fp.unud.ac.id, 2010).

Proses perkecambahan pada kultur embrio dimulai dari Benih menyerap air melalui testa, Embrio mengalami imbibisi, membengkak, pembelahan sel dimulai, dan embrio menembus kulit biji, Protocorm terbentuk dari massa embrio, Diferensiasi organ dimulai dg pembentukan meristem tunas & rhizoid, Jika ada cahaya, daun terbentuk, diikuti oleh akar sejati. Rhizoid & protocorm tidak berfungsi lagi dan terdegenerasi (Slater et.al., 2003).

Faktor yang mempengaruhi kesuksesan kultur embrio adalah (Zulkarnain, 2009) :

·         Genotipe : Pada suatu spesies, embrio mudah diisolasi dan tumbuh, sementara tanaman lain susah

·         Tahap (stage) embrio diisolasi The bigger the better

·         Kondisi tumbuh tanaman Inang : Sebaiknya ditumbuhkan di rumah kaca/ kondisi terkontrol. Embrio mesti cukup besar dan berkualitas tinggi

Kondisi media kultur embrio harus diperhatikan, seperti Hara makro dan mikro, Ph 5.0 – 6.0, Sukrosa sbg sumber energi. Embrio belum matang perlu 8 – 12%, matang perlu 3%, Auksin dan sitokinin tidak diperlukan. GA untuk memecahkan dormansi, Vitamin (optional), Senyawa organik (opt), air kelapa, casein hydrolisate, glutamin (penting) (Luri, 2009).

Kultur embrio adalah kultur jaringan tanaman dengan menggunakan eksplan berupa embrio tanaman. Embrio tidak dimaksudkan untuk menumbuhkan kalus dari embrio yang digunakan. Embrio diharapkan tetap mempertahankan integritasnya dan tumbuh menjadi tanaman. Kultur embrio ditujukan untuk membantu perkecambahan embrio menjadi tanaman lengkap (George and Sherrington, 1984).

Embrio yang dikulturkan harus berada dalam kondisi Menunjukkan masa dormansi yang panjang, Embrio hibrida hasil penyilangan interspesifik yang tidak kompatibel dengan endospermnya, Embrio dengan endosperm yang rusak seperti kelapa kopyor, Embrio tanpa endosperm seperti pada anggrek. 2 macam kultur embrio: Kultur embrio yg belum matang, utk mencegah keguguran : embryo rescue, Kultur embrio matang, utk merangsang perkecambahan : embryo culture. Isolasi secara steril embrio matang ataupun belum matang, dengan tujuan memperoleh tanaman yang viabel (Wetter dan Constabel, 1991).

Kondisi Lingkungan kultur embrio yaitu memerlukan Oksigen (perlu oksigen tinggi), Cahaya : kadang embrio perlu ditumbuhkan dalam gelap selama 14 hari, kemudian ditransfer ke cahaya untuk merangsang sintesa klorofil, Suhu : kadang perlu perlakuan dingin (vernalisasi, 4oC) untuk memecah dormansi (Sugito dan Nugroho, 2004).

a.       Teknik Kultur Embrio

Agar memperoleh sifat-sifat yang diinginkan, seringkali penyilangan dilakukan dengan tanaman liar atau bahkan persilangan dengan varietas yang berbeda bila sifat-sifat tersebut tidak terdapat pada kerabat dekatnya. Penyerbukan dan pembuahan dapat berhasil namun setelah persilangan buatan seringkali dijumpai permasalahan antara lain buah yang terbentuk gugur saat embrio belum matang, terbentuk buah dengan endosperm yang kecil atau terbentuk buah dengan embrio yang kecil dan lemah. Kondisi tersebut dapat menghambat program pemuliaan tanaman karena embrio muda, embrio dengan endosperm kecil atau embrio kecil dan lemah seringkali tidak dapat berkecambah secara normal dalam kondisi biasa. Mengatasi hal tersebut di atas maka embrio tersebut dapat diselamatkan danditanam secara aseptis dalam media buatan sehingga dapat berkecambah danmenghasilkan tanaman utuh.

b.      penyelamatan embrio (embryo rescue).

Selain teknik penyelamatan embrio inidikenal juga teknik  kultur embrio (embryo culture), yaitu penanaman embrio dewasa pada media buatan secara aseptis. Aplikasi kultur embrio ini antara lain perbanyakan tanaman, pematahan dormansi untuk mempercepat program pemuliaan serta perbanyakantanaman yang sulit berkecambah secara alami, misalnya anggrek, kedelai, pepaya, kacang tanah dan kelapa kopyor. Embryo Culture atau kultur embrio adalah isolasi steril dari embrio muda( immature embryo) atau embrio dewasa/tua ( mature embryo) secara in-vitro dengan tujuan untuk memperoleh tanaman yang lengkap atau viabel. Kultur embryo dapat dikatakan sebagai kultur biji (seed kultur) yaitu kultur yang bahan tanamnnya menggunakan biji atau seedling. Kultur embryo dapat dilakukan untuk menyelamatkan embrio yang sudah matang agar tidak mati akibat serangan hama dan penyakit, penyelamatan embryo yang belum matang dan menumbuhkannya pada media kultur yangsesuai. Berdasarkan tujuan dan jenis embrio yang dikulurkan, kultur embrio digolongkan menjadi:

c.       Kultur Embrio Muda (Immature Embryo Culture)

Tujuan mengkulturkan embrio muda ini adalah menanam embrio yang terdapat pada buah muda sebelum buah tersebut gugur (mencegah kerusakan embrio akibat buahgugur) sehingga teknik ini disebut sebagai Embryo Rescue (Penyelamatan Embrio).Kondisi seperti ini biasanya sering dijumpai pada buah hasil persilangan, dimana absisi buah kerap kali dijumpai setelah penyerbukan dan pembuahan. Contohnya adalah pada persilangan anggrek Vanda spathulata dimana absisi atau gugur buah pada saat buahmasih muda yaitu setelah berumur 3 bulan setelah persilangan padahal buah anggrek.

Vanda spp. akan mengalami masak penuh setelah berumur 6 bulan. Apabila buah initidak diselamatkan atau dipetik dan kemudian dikecambahkan maka tidak akan diperoleh buah hasil persilangan. Perkecambahan biji yang masih muda di lapangan sangat sulit bahkan pada beberapa kasus hampir tidak mungkin bisa terjadi. Oleh karena itu, buahyang belum tua (2 – 4 bulan) pada anggrek Vanda tersebut kemudian dipanen dandikecambahkan secara in-vitro.Budidaya embrio muda ini lebih sulit dibandingkan dengan budidaya embrio yangtelah dewasa. Embrio yang terdapat dalam biji belum sepenuhnya berkembang dan belummembentuk radicula dan plumula yang sempurna. Selain itu, biji velum memilikiendosperm atau cadangan makanan yang memadai dalam mendukung perkembangan dan perkecambahan embrio. Oleh karena itu, perlu disediakan media kultur yang memadai bagi perkembangan embrio muda ini. Pada beberapa kasus kadangkala dijumpai embriomasih dorman sehingga perlu ditambahkan hormon tanaman yang bisa memecahkandormansi biji ini, misalnya Giberellin.

d.      Kultur Embryo Dewasa (Mature Embryo Culture)

Kultur embrio dewasa dilakukan dengan membudidayakan embrio yang telahdewasa. Embrio ini diambil dari buah yang telah masak penuh dengan tujuan merangsang perkecambahan dan menumbuhkan embrio tersebut secara in-vitro. Teknik kultur iniumumnya dikenal dengan sebutan Kultur Embrio (Embryo Culture). Kultur embrio lebih mudah dilakukan dibandingkan dengan penyelamatan embrio. Hal ini disebabkan karena embrio yang ditanam adalah embrio yang telah berkembang sempurna sehingga media tanaman yang digunakan juga sangat sederhana.

Ø  Faktor yang Mempengaruhi Teknik Kultur Embrio

Faktor yang mempengaruhu kesuksesan kultur embrio adalah:

1.Genotipe

Pada suatu spesies, embrio mudah diisolasi dan tumbuh, sementara pada tanaman lain agak lebih susah.

2.Tahap (stage) embrio diisolasi

Pada tahapan yang lebih besar (lebih tinggi) lebih baik bila dilakukan pengisolasian embrio.

3.Kondisi tumbuhan

Sebaiknya ditumbuhkan di rumah kaca/ kondisi terkontrol. Embrio harus cukup besar dan berkualitas tinggi.

4.Kondisi media

·         Hara makro dan mikro

·         pH 5.0 – 6.0c. Sukrosa sebagai sumber energi. Embrio yang belum matang perlu 8– 12%,embrio matang perlu 3%

·         Auksin dan sitokinin tidak diperlukan. GA diperlukan untuk memecahkan dormansi

·         Vitamin (optional)

·         Senyawa organik (opt), air kelapa, casein hydrolisate, glutamin (penting)

5.Lingkungan

·         Oksigen (perlu oksigen tinggi)

·         Cahaya : kadang embrio perlu ditumbuhkan dalam gelap selama 14 hari,kemudian ditransfer ke cahaya untuk merangsang sintesa klorofil

·         Suhu : kadang perlu perlakuan dingin (vernalisasi, 40°C) untuk memecah dormansi

2.2. Kultur Anther

Anther diperoleh dari tunas bunga dan dapat dikulturkan pada medium padat atau cair sehingga terjadi embryogenesis. Selain itu pollen juga dapat diambil secara aseptic dan dikulturkan pada medium cair. Proses perbanyakan tanaman haploid dengan menggunakan gametofity jantan semacam ini disebut sebagai androgenesis (Yuwono, 2008).

Kultur anther merupakan salah satu teknik dasar penerapan bioteknologi untuk pemuliaan tanaman. Dari kultur anther akan didapatkan tanaman haploid. Pembentukan tanaman haploid melalui pembentukan kalus atau androgenesis langsung. Manfaat tanaman haploid dalam pemuliaan tanaman adalah apabila digandakan kromosomnya dengan kolkhisin atau melalui fusi protoplas akan diperoleh tanaman 100% homozigot (http://www.rudyct.com, 2010).

Kultur anther dan serbuk sari digunakan untuk menghasilkan tanaman monoploid atau haploid. Meskipun mutasi mudah terjadi dalam sel biakan   namun banyak mutasi tersebut bersifat resesif. Oleh karena itu tidak terdektesi karena sel – selnya dalam keadaan diploid atau poliploid (Wijayani, 1994).

Kegunaan kultur anther antara lain mampu menghasilkan tanamn monohaploid yang dapat digunakan untuk pemuliaan tanaman selanjutnya dan dapat menghilangkan sifat resesif, serta dari monohaploid dapat dihasilkan derivate yang dihaploid (diploid) dengan cara merangkapkan kromosom dengan perlakuan kolkisin dan mengadakan silangan tanaman monohaploid dan untuk membuat tanaman homozigot (Bennet dan O’neil, 1989).

Tanaman haploid dapat dikembangkan dengan menggunakan teknik kultur invitro anther dan pollen. Anther diperoleh dari tunas bunga dan dapat dikulturkan pada medium padat atau cair sehingga terjadi embriogenesis. Selain itu pollen juga dapat diambil secara aseptik dan dikulturkan pada medium cair. Proses perbanyakan tanaman haploid dengan menggunakan gametofit jantan semacam ini diesebut sebagai androgenesis. Ada dua macam androgenesis yaitu androgenesis langsung dan tidak langsung. Androgenesis langsung adalah proses pembentukan plantlet haploid dengan menggunakan kultur anther, sedangkan pada androgenesis tidak langsung adalah plantlet terbentuk melalui pembentukan kallus yang kemudian mengalami regenerasi menjadi plantlet (Yuwono, 2008).

Faktor – faktor yang menentukan hasil akhir kultur anther adalah kondisi pertumbuhan tanaman donor seperti temperatur, fotoperiodisasi dan intensitas cahaya, umur tanaman donor (tunas yang digunakan berasal dari pembungaan awal), dan tingkat perkembangan pollen paling baik pollen digunakan pada tringkat pembelahan mitosis pertama (Hendaryono, 2004).

Untuk menghasilkan haploid terbaik, kondisi optimum yang harus diperhatikan untuk setiap kultur atau spesies yaitu, tahap perkembangan mikrospora, komposisi media, pra perlakuan anther, sumber, kondisi, dan umur tanaman dimana anther diambil (Nasir, 2002).

Media yang biasa digunakan untuk kultur jaringan adalah media MS   yang mana media ini mengandung jumlah hara organik yang layak untuk memenuhi kebutuhan banyak jenis sel tanaman. Medium ini sudah digunakan banyak orang karena karena medium ini cocok untuk berbagai tanaman (Rahardja, 2001).

Produksi kalus dan embrio somatik dari kultur anther dan pollen telah berhasil dilakukan pada berbagai spesies. Yang menarik disini adalah produksi embrio haploid yaitu embrio yang hanya memiliki satu sel dari pasangan kromosom normal. Ini dihasilkan dari jaringan gametofitik pada anther. Jumlah kromosom dapat digandakan kembali dengan pemberian bahan kimia  seperti cholcicine dan tanaman yang dihasilkan akan memiliki pasangan-pasangan kromosom identik (http://www.fpunud.ac.id, 2010).

Langkah terpenting dan kritis dari teknik kultur anther adalah pembentukan tingkat perkembangan serbuk sari yang paling tebal untuk dijadikan eksplan sehingga androgenesis dapat berlangsung. Anther yang diinginkan adalah anther dengan serbuk sari pada fase mid. Uninucleate. Fase tersebut memiliki ciri yaitu hanya ada 1 nukleus untuk setiap sel yang berada di tengah. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dan melakukan pewarnaan tertentu (umumnya menggunakan acetocarmin atau aceto orcein) untuk mendapatkan gambar yang kontras (Zulkarnain, 2000).

Auksin bermanfaat untuk proses pemanjangan sel pada jaringan tunas muda. Di samping itu, auksin juga berpengaruh dalam pembentukan akar. Untuk tanaman dewasa, auksin bermanfaat dalam pertumbuhan buah. Pada konsentrasi yang rendah, auksin berpengaruh baik pada proses pemanjangan sel. Sebaliknya, dalam konsentrasi yang terlalu tinggi auksin justru dapat menghambat. Oleh karena itu, penggunaan auksin harus sungguh-sungguh memperhatikan dosis. Hormon yang termasuk ke dalam golongan auksin di antaranya adalah 2,4 D   (2,4-Dichlorophenoxy acetic acid) (Rahardja, 2001).

2.3. Media Kultur In Vitro

Tujuan utama kultur jaringan tanaman yaitu untuk perbanyakan bagian tanaman. Perbanyakan dapat dilakukan dengan cara merangsang pertumbuhan tunas cabang dan percabangan aksiler atau merangsang terbentuknya tunas pucuk tanaman secara adventif, baik secara langsung maupun kalus terlebih dahulu. Bagian-bagian tanaman dapat tumbuh secara optimal apabila menggunakan media tepat yang digunakan untuk pemenuhan nutrisi tanaman. Media yang digunakan harus mengandung mineral, gula, vitamin dan hormon dengan perbandingan yang dibutuhkan secara tepat. Media perlu ditambahkan agar untuk mendapatkan media semi padat yang fungsinya untuk meletakkan atau membenamkan jaringan tanaman (Wetherell, 1976).

Menurut Prakash et al. (2004), pertumbuhan tanaman in vitro sebagian besar dipengaruhi oleh komposisi media kultur. Komponen media yang utama dalam kultur jaringan tanaman yaitu garam, mineral dan gula sebagai sumber karbon dan air. Komponen lain merupakan tambahan organik, pengatur pertumbuhan, gell agar. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan antara lain Murashige dan Skoog (MS), Linsmaier dan Skoog (LS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dan lain-lain. Meskipun beberapa jumlah komposisi dirubah untuk langkah-langkah kultur jaringan dan spesies tanaman berbeda, media MS (Murashige dan Skoog, 1962) dan LS (Linsmaier dan Skoog, 1965) paling banyak digunakan dalam kultur jaringan tanaman.

Setiap unsur yang terkandung dalam media mempunyai fungsi bagi metabolisme tanaman atau proses kultur jaringan. Media yang digunakan untuk kultur sel dalam bentuk larutan nutrisi, padat dan cair. Media MS sebagai media fundamental yang mengandung nutrisi makro anorganik, nutrisi mikro anorganik, nutrisi Fe, vitamin, organik dan zat pengatur pertumbuhan tanaman (phytohormon). Phytohormon yang paling banyak digunakan dalam kultur jaringan tanaman (khususnya media MS) yaitu (Storr, 1985):

1. Auksin : NAA, IAA dan 2,4 D

2. Sitokinin : BAP dan Kinetin

Komposisi nutrisi makro anorganik mempunyai fungsi, khususnya untuk metabolisme tanaman. Komposisi tersebut mengandung protein, karbohidrat, asam nukleat, lipid dan lain-lain. Unsur-unsur nutrisi makro anorganik dalam media MS antara lain:

1. KNO3

2. NH4NO3

3. CaCl2.H2o

4. MgSo4.7H2O

5. KH2PO4

Sedangkan unsur-unsur nutrisi mikro anorganik dalam media MS antara lain:

1. MnSO4.4H2O

2. ZnSO4.4H2O

3. H3BO3

4. Kl

Salah satu unsur Fe berasal dari komponen nutrisi mikro anorganik. Unsur Fe dikatagorikan dalam larutan stok C karena nutrisi ini tidak dapat larut dengan unsur lain. Oleh karena itu, Fe harus dipisahkan dari unsur lain.

Vitamin yang digunakan dalam media MS hanya thiamine (vitamin B1). Komponen ini diperlukan untuk metabolisme karbohidrat dan biosintesis dari asam amino. Vitamin telah terbukti sebagai komponen yang penting dalam kultur jaringan tanaman. Vitamin lain yaitu seperti vitamin C dan vitamin E hanya digunakan jika diperlukan untuk pertumbuhan eksplan maksimum. Unsur organik dalam media MS seperti sukrosa atau gula lain menambahkan ke dalam media untuk menyediakan CO2.

 III. BAHAN DAN METODE

3.1. Tempat dan  Waktu

Pelaksanaan praktikum Kultur Embrio dan Kultur Anther ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Riau  pada jadwal praktikum yang telah ditetapkan, yaitu setiap hari Selasa pukul 08.00– selesai.

3.2. Bahan dan Alat

            Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah bunga rosella sebagai bahan tanaman yang dijadikan eksplan didalam kultur embrio, jantung pisang sebagai bahan tanaman yang digunakan didalam kultur anther, media MS, aquadest, alkohol 90 % yang berguna untuk mematikan kuman.

Adapun alat yang digunakan pada percobaan ini adalah botol kultur sebagai tempat penanaman eksplan, petridish untuk tempat meletakkan eksplan, LAF (Laminar Air Flow) untuk menabur atau tempat menanam, erlenmeyer sebagai wadah larutan, scalpel untuk memotong eksplan, pinset untuk menjepit eksplan pada waktu menanam, handsprayer untuk menyemprotkan alkohol, lampu bunsen untuk membakar eksplan dan mensterilkan scalpel dan pinset, gunting untuk membuang bagian tanaman yang tidak terpakai, kertas label, baju lab untuk dipakai ketika bekerja sehingga mengurangi kontaminasi, masker sebagai penutup mulut, rak kultur sebagai tempat meletakkan botol kultur.

3.3. Metode Pelaksanaan

3.3.1. Cara Pembuatan Media

·         Melarutkan semua larutan yang dibutuhkan dari media MS untuk setiap larutan stok

·         Ketika semua unsur sudah larut, tambahkan 30 gr sukrosa dan tambahkan volume dengan akuades sampai 900 ml kemudian aduk menggunakan stirrer.

·         Mengecek pH menggunakan pH meter.

·         Jika pH kurang dari 5,8 tambahkan NaOH sampai pH mencapai 5,8

·         Jika pH lebih dari 5,8 tambahkan HCl sampai pH mencapai 5,8

·         Masak media yang telah siap dengan ditambahkan 8 gr agar bubuk sampai mendidih

·         Memasukkan media yang telah mendidih ke dalam botol kultur dan ditutup menggunakan plastik.

·         Media di autoklaf pada 121oC-126oC selama 15 menit.

·         Media yang sudah di autoklaf disimpan dalam rak inkubasi.

3.3.2. Cara Kerja Kultur Embrio

·         Menyiapkan alat dan bahan yang diperluakan

·         Persiapan media kultur

·         Persiapan eksplan (eksplan yang digunakan yaitu bunga rosella)

·         Sterilisasi alat yang akan digunakan (scalpel, pinset, petridish)

·         Sterrilisasi eksplan (bunga rosella)

·         Isolasi eksplan (bunga rosella) mengambil embrio

·         Penanaman embrio kedalam media didalam botol kultur

·         Berikan kertas label pada botol kultur (tanggal, kelompok, kelas)

·         Setelah selesai dilakukan penanaman maka botol kultur diletakkan di rak kultur

3.3.3. Cara Kerja Kultur Anther

·         Menyiapkan alat dan bahan yang diperluakan

·         Persiapan media kultur

·         Persiapan eksplan (eksplan yang digunakan yaitu jantung pisang)

·         Sterilisasi alat yang akan digunakan (scalpel, pinset, petridish)

·         Sterrilisasi eksplan (jantung pisang)

·         Isolasi eksplan (jantung pisang) mengambil anther

·         Penanaman anther pisang kedalam media didalam botol kultur

·         Berikan kertas label pada botol kultur (tanggal, kelompok, kelas)

·         Setelah selesai dilakukan penanaman maka botol kultur diletakkan di rak kultur

 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Kultur Embrio

Adapun hasil dari praktikum kultur embrio :

     

Pembahasan :

Dari hasil percobaan dapat diketahui bahwa eksplan yang tumbuh pada botol kultur pertama dan kedua terkontaminasi. Kontaminasi bukan berasal dari embrio dikarenakan biji yang disterilkan tidak terkontaminasi dan bebas serangan bakteri dan jamur. Pelaksanaan penanaman telah teliti, eksplan tidak terkontaminasi dan serangga atau hewan kecil tidak masuk kedalam botol kultur.. Hal ini dikarenakan embrio telah disterilkan dengan menggunakan alkohol 96 % dengan baik. Hal ini disesuaikan dengan literatur yang tersesdia  yang menyatakan bahwa perbanyakan in vitro memberi alternatif lingkungan terproteksi, nutrisi yang cukup dan bebas serangan bakteri atau jamur. Mensterilisasikannya dengan merendamkan pada alkohol 96 %.

Dari hasil percobaan diketahui kontaminan berasal dari medium. Hal ini dikarenakan medium yang dipakai dalam pembuatannya tidak disterilisasi dengan sempurna. Kontaminan yang terdapat pada dimedium botol kultur pertama ini adalah jamur, sebab terdapat hifa-hifa halus diatas medium dan penyebarannya berasal dari pinggiran medium hingga ke seluruh bagian permukaan medium. Sedangkan kontaminan yang terdapat pada medium botol kultur kedua ini disebabkan oleh bakteri. Hal ini dikarenakan pada medium tersebut terlihat berwarna bening kecoklatan dan tidak terdapat miselium.

Menurut Zulkarnain (2009) yang menyatakan bahwa beberapa sumber kontaminasi mikroorganisme pada sistem kultur jaringan dapat dikemukakan sebagai berikut:

·      Medium sebagai akibat sterilisasi yang tidak sempurna.

·      Eksplan

·      Lingkungan kerja dan pelaksanaan penanaman yang kurang hati – hati.

·      Dari serangga atau hewan kecil yang berhasil masuk kedalam botol kultur.

4.2. Kultur Anther

Adapun hasil dari praktikum kultur anther yaitu :

   

Gambar 8. Kultur anther pisang tampak atas             

   

Gambar 9. Kultur anther pisang tampak bawah

Pembahasan :

Dari hasil percobaan yang telah dilakukan diketahui bahwa hasil dari kultur anther telah terkontaminasi. Dari hasil yang terlihat kontaminasi berasal dari anther, hal ini disebabkan oleh kondisi eksplan, alat, media atau ruangan yang kurang steril. Kontaminasi yang terlihat dari anther disebabkan alat (pinset) yang pada saat menjepit enther lerlalu kuat sehingga menyebabkan luka pada anther. Hal ini yang menyebabkan disekitar anther terdapat bercak hitam dan terjadinya kontaminasi pada anther.

Hendaryono dan Wijayani (1994) yang menyatakan bahwa teknik perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan dilaksanakan pada kondisi laboratorium yang aseptik begitu juga dengan peralatannya sehingga menghasilkan eksplan yang tidak terkontaminasi. Tingkat keberhasilan penanaman eksplan (anther) dalam percobaan ini adalah dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah sumber, kondisi dan umur tanaman telah sesuai untuk ditanam sehingga eksplan tidak terkontaminasi. Hal ini sesuai dengan literatur Nasir (2002) yang menyatakan bahwa untuk mengahasilkan haploid terbaik, kondisi optimum yang harus ditentukan untuk setiap kultivar atau spesies yaitu tahap perkembangan mikrospora, komposisi media, praperlakuan anther, sumber, kondisi, dan umur tanaman dimana anther diambil.

Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan dalam kultur jaringan antar lain :

a.Kondisi bahan tanam, jenis dan fisiologi eksplan

b.Media, berkaitan dengan ketersediaan nutrisi, sterilitas media

c.Teknik perbanyakan, misal teknik yang digunakan

d.Kondisi lingkungan kerja, meliputi terilisali bahan dan alat

 V. PENUTUP

5.1. Kesimpulan

Dari percobaan yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa pada percobaan kultur embrio eksplan yang terdapat pada botol kultur terkontaminasi. Kontaminasi yang berasal dari medium dan disebabkan oleh jamur dan bakteri. Dan pada percobaan kultur anther juga terkontaminasi yang berasal dari anther tersebut. Kontaminasi yang disebabkan oleh alat yang tidak steril.

  

5.2. Saran

Sebaiknya dalam melakukan teknik kultur jaringan dilakukan sterilisasa secara berulang agar keadaan steril baik alat, media maupun eksplan.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2009.Kultur Jaringan.http://kultur-jaringan.blogspot.com : diakses pada tanggal 29 April 2013

Santoso, U dan Nursandi, U., 2005. Kultur Jaringan Tanaman. UMM Press. Malang.

Sugito, H dan A. Nugroho, 2004. Teknik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya, Yogyakarta.

Wetter, L. R. dan F. Constabel, 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman. ITB Press. Bandung.

Yuwono, T., 2008. Bioteknologi Pertanian. UGM Press, Yogyakarta.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Bumi Aksara, Jakarta.